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本酶催化的反应为L-Proline + 2-Oxoglutarate + O2 = Cis-3-Hydroxy-L-Proline + Succinate + CO2,系统名称为L-Proline,2-Oxoglutarate:oxygen Oxidoreductase (3-Hydroxylating),需要铁(II)才有活性。与参与胶原生物合成的脯氨酸羟化酶 [EC 1.14.11.2(原胶原-脯氨酸双加氧酶)和 EC 1.14.11.7(原胶原-脯氨酸 3-双加氧酶)] 不同,该酶不需要抗坏血酸即有活性,尽管抗坏血酸可提高酶活性 [2]。该酶对 L-脯氨酸特异,D-脯氨酸、trans-4-羟基-L-脯氨酸、cis-4-羟基-L-脯氨酸和 3,4-脱氢-DL-脯氨酸均非底物 [2]。