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本酶催化的反应为ATP + L-Glutamate + TRNAGlx = AMP + Diphosphate + L-Glutamyl-TRNAGlx，系统名称为L-Glutamate:tRNAGlx Ligase (AMP-Forming)，当该酶作用于tRNAGlu时，它催化与EC 6.1.1.17，谷氨酸---tRNA连接酶相同的反应。然而，它的辨别能力降低，因此也能形成谷氨酰-tRNAGln。已发现这种特异性的放宽是由于tRNA中特异识别反密码子第三位的环缺失所致[1]。这解释了例如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中该酶既能识别tRNA1Gln（UUG反密码子）和tRNAGlu（UUC反密码子）、但不能识别tRNA2Gln（CUG反密码子）的能力。该酶能同时识别tRNAGlu和一种tRNAGln同工受体，源于它们共享一个主要身份元件，即U34的超修饰衍生物（5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷）。谷氨酰-tRNAGln在被EC 6.3.5.7，谷氨酰胺酰-tRNA合酶（谷氨酰胺水解型）转化为谷氨酰胺酰-tRNAGln之前不用于蛋白质合成。
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