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本酶催化的反应为ATP + L-Pyrrolysine + TRNAPyl = AMP + Diphosphate + L-Pyrrolysyl-TRNAPyl,系统名称为L-Pyrrolysine:tRNAPyl Ligase (AMP-Forming),在诸如巴氏甲烷八叠球菌 Methanosarcina barkeri 等将修饰氨基酸吡咯赖氨酸(Pyl)掺入某些甲胺甲基转移酶的生物中,一种带有 CUA 反密码子的特殊 tRNAPyl 可被这种 II 类氨酰-tRNA 连接酶直接装载吡咯赖氨酸。该酶对底物吡咯赖氨酸特异,它不能被赖氨酸或任何其他天然氨基酸替代 [1]。